La tuberculosis (TB) es una enfermedad infectocontagiosa que afecta principalmente los pulmones. Mycobacterium tuberculosis (Mtb) el agente etiológico de la TB, es un bacilo aerobio ácido-alcohol resistente que posee una pared celular compleja rica en lípidos, asociada con la resistencia antibiótica, y algunos mecanismos de defensa que le permiten evadir la respuesta inmune del hospedero, posicionando a Mtb como un patógeno intracelular exitoso. El bacilo Calmette-Guérin (BCG), una cepa atenuada de Mycobacterium bovis desarrollada en 1921 y desde entonces distribuida a nivel mundial, es la única vacuna autorizada para la prevención de la TB. Si bien la BCG provee una protección significativa contra las formas diseminadas y meníngeas de TB en niños, su eficacia frente a la TB pulmonar en adultos muestra variaciones significativas (0-80%). Lo anterior, sumado a la alta incidencia de la enfermedad, la coinfección con el virus de inmunodeficiencia humana (VIH) y la aparición de cepas de Mtb multirresistentes o extremadamente resistentes a los antibióticos anti-tuberculosos (MDR y XDR respectivamente), han hecho necesaria la búsqueda de nuevos blancos de atenuación y dianas terapéuticas, encaminado al desarrollo de vacunas y fármacos más eficaces que permitan la erradicación de la enfermedad. Diferentes estudios han evidenciado la importancia de las proteínas transmembranales en la supervivencia y proliferación del bacilo tuberculoso. Entre ellas se destacan las encargadas del transporte de cationes metálicos en contra del gradiente de concentración (ATPasas tipo P) y las que translocan componentes estructurales desde el citosol hacia la pared celular ayudando así a la construcción de la compleja pared que caracteriza al género Mycobacterium (Mycobacterial membrane protein large o MmpL). En el presente trabajo, partiendo de un doble mutante de Mtb defectivo en los transportadores de membrana CtpF y MmpL7 previamente construido, se usará un sistema γδ resolvasa para eliminar el marcador de resistencia a higromicina introducido durante su construcción. Específicamente, CtpF es un transportador implicado en el eflujo de Ca2+ y en la respuesta a distintas condiciones asociadas al proceso de infección tales como estrés oxidativo, hipoxia y latencia, mientras que MmpL7 está implicado en la translocación del dimicocerosato de tiocerol (PDIM), un reconocido factor de virulencia importante la interacción hospedero-patógeno y durante la invasión de macrófagos. De esta manera, se obtendrá una cepa doble mutante desmarcada (MtbH37Rv∆ctpF∆mmpL7Δhyg), que cumplirá con los dos requerimientos de seguridad establecidos para el estudio clínico de cepas atenuadas de Mtb: la presencia de dos mutaciones no relacionadas y la remoción de marcadores de resistencia a antibióticos introducidos durante su construcción. En la segunda parte del proyecto, se usará un modelo de infección in vitro de macrófagos alveolares murinos de la línea MH-S para evaluar el efecto de las mutaciones de los genes ctpF y mmpL7 en la proliferación intracelular de la cepa doble mutante desmarcada (MtbH37Rv∆ctpF∆mmpL7Δhyg), y se comparará con la cepa parental (MtbH37Rv) y las cepas mutantes sencillos (MtbH37Rv∆ctpFΔhyg y MtbH37Rv∆mmpL7Δhyg). Todo lo anterior brindará información importante sobre la posible atenuación del doble mutante en CtpF y MmpL7, específicamente en cuanto a su capacidad proliferativa en su nicho primario, y dará paso a futuros ensayos en modelos in vivo para proponer a la cepa MtbH37Rv∆ctpF∆mmpL7Δhyg como candidato a vacuna anti-TB.