1.Introducción La Giardia lamblia es un parásito protozoario ampliamente diseminado en el mundo, pero especialmente en las poblaciones más desprotegidas que no cuentan con servicios sanitarios adecuados. Produce una patología intestinal llamada giardiosis que puede conducir a problemas de mala absorción y retraso en el crecimiento. El ciclo de vida de Giardia presenta dos formas distintas morfológicamente, trofozoítos y quistes. La enfermedad es causada por el trofozoíto y se presenta frecuentemente con diarrea aguda o crónica. Los trofozoítos colonizan la parte superior del intestino delgado del hospedero donde puede adherirse a las células epiteliales, crecer y proliferar; por acción de los fluidos intestinales pueden descender al íleo, parte baja del intestino, donde por mecanismos desconocidos pueden diferenciarse en quistes, que luego pueden pasar a las heces (Adam 2001, Gillin et al. 1996, Thompson et al. 1993). Uno de los aspectos del ciclo de vida de Giardia que es de gran interés es el conjunto de eventos que llevan a la diferenciación entre los dos estadios del ciclo biológico del parásito, en particular la enquistación que conduce a la forma infectiva del microorganismo. La diferenciación al estado de quiste representa unas de las respuestas adaptativas a condiciones drásticas más primitivas, desarrolladas por los organismos nucleados en la evolución. Sin embargo es poco lo que se conoce acerca de los eventos y mecanismos moleculares y bioquímicos que anteceden y conducen este proceso, en particular la identificación de moléculas claves para su desarrollo y que puedan servir al mismo tiempo como sus marcadores (Luján et al. 1997). Hasta el momento son pocas las moléculas que han sido identificadas y que podrían servir para este fin (proteínas de la pared del quiste CWP 1 y 2) (Luján et al. 1995), y son productos relativamente tardíos del proceso, no señales inductoras o generadoras del mismo. Debido a la poca información que se tiene acerca de los aspectos moleculares que conducen al desarrollo de la enquistación en Giardia, principalmente en las primeras etapas, se propone con el desarrollo de este trabajo contribuir al estudio bioquímico de este evento, en particular de las fases tempranas, que son de vital importancia en el control del proceso, definiendo las condiciones óptimas del estímulo para que la diferenciación se lleve a cabo in vitro reproduciblemente, determinando la importancia de eventos moleculares básicos como es la replicación del DNA, además de la búsqueda de moléculas que sean de utilidad como indicadoras de las diferentes sub-etapas cronológicas de la enquistación (y su posible función durante el proceso). Adicionalmente, se quiere evaluar la hipótesis de que posiblemente sea necesario contar con un cultivo celular sincrónico para la enquistación se lleve a cabo de una forma eficiente, además para facilitar el monitoreo y la definición de factores determinantes en el proceso. El cultivo in vitro axénico de Giardia proporciona poblaciones asincrónicas de parásitos, es decir, que se encuentran en diferentes etapas del ciclo celular. La sincronización de las células en continua división podría lograrse por la imposición de bloqueadores metabólicos reversibles que arresten las células en un punto específico del ciclo celular. En un estudio anterior realizado en el grupo de investigación se evaluaron diferentes inhibidores de la síntesis de DNA como son timidina, hidroxiúrea, fluorouracilo y afidicolina, resultando preliminarmente que con esta última se obtenían los mejores resultados de inhibición y reversibilidad, ya que al ser liberada la inhibición, se obtiene una onda sincrónica en la síntesis de DNA (Bastidas y Santamaría 2001). Teniendo bien definido el sistema experimental para la obtención de quistes, el análisis de las macromoléculas involucradas en el proceso puede realizarse de una forma más sencilla, como es el caso de algunas enzimas claves que participan en el metabolismo energético en los dos estadios y que aparentemente estarían expresadas diferencialmente. Una de las principales características de Giardia es que no presenta mitocondria hay por tanto ausencia del ciclo de Krebs y de fosforilación oxidativa, y todas las enzimas del metabolismo de carbohidratos están presentes en el citoplasma (Lindmark 1980; Müller 1988; Adam 2001). La glucosa y otros azúcares son oxidados a fosfoenolpiruvato (PEP) y posteriormente a piruvato por la vía Embden-Meyerhof. El piruvato es oxidado a acetil-CoA, un paso muy importante y característico de protozoarios amitocondriales, catalizado por la enzima piruvato:ferredoxin oxidoreductasa (PFOR). El acetil-CoA es oxidado a acetato con la producción de una molécula de ATP en una reacción catalizada por la acetil-CoA sintetasa (Müller 1988; Sánchez and Müller 1996), o alternativamente puede ser reducido a acetaldehído y posteriormente a etanol en dos reacciones catalizadas por la enzima bifuncional aldehído/alcohol deshidrogenasa (ALDH/ADHE) (Sanchéz 1998). Al parecer, el producto final del metabolismo de carbohidratos depende de las condiciones del medio, principalmente de la concentración de oxigeno. En un medio anaerobio el mayor producto es la alanina. A concentraciones relativamente bajas de oxigeno ( 0.25 M) es estimulada la producción de etanol y disminuye la de alanina, y a altas concentraciones de oxigeno ( 46 M) predomina la producción de acetato y CO2, mientras que la producción de alanina se suspende (Paget et al. 1990; Paget et al. 1993). La conversión de piruvato a alanina se lleva a cabo por dos reacciones acopladas: la enzima glutamato deshidrogenasa (GDH) convierte el -cetoglutarato a glutamato y la alanina aminotransferasa cataliza la reacción que produce alanina a partir de piruvato y glutamato. En nuestro laboratorio analizamos previamente los niveles de los mRNAs de PFOR, ACS, ADHE y GDH (Niño 2002, Niño and Wasserman 2003), nuestros resultados mostraron que en los quistes solo estan presentes los mRNAs de ACS y GDH (en mayor abundancia mRNA de GDH) , y que en los trofozoitos están presentes los mRNAs de las cuatro enzimas (en mayor abundancia mRNAs de PFOR y ACS). De estos resultados se podría desprender que en el trofozoíto hay una generación preferencial de Acetato. En los quistes se observó un alto nivel del mensajero para GDH y uno muy bajo para ACS, lo que indicaría que hay generación preferencial de Alanina. La Giardia lamblia puede generar acetato, etanol y alanina como productos de su metabolismo energético. Paget et al. (1993) reportaron que la preferencia por uno de esos productos finales u otro parece ser regulada por la concentración de oxigeno presente en el medio. Sin embargo, aunque los quistes se encuentran normalmente en un medio con alta presión de oxigeno, la captación del mismo es muy baja (apenas un 10%) comparada con la de los trofozoítos (Paget et al. 1989). Nosotros planteamos la hipótesis que es el consumo de oxígeno, más que su concentración, el que está relacionado con la activación del metabolismo que resulte en la expresión de los genes de PFOR y de ADHE en el trofozoito (Niño 2002; Niño and Wasserman 2003