Este trabajo se plantea como una pequeña parte de una de las líneas de investigación planteadas en nuestro grupo (LIBBIQ); Metabolismo del NAD en protozoos. Son modelos de esta línea Giardia, Plasmodium y Leishmania. Todos ellos parásitos de alta incidencia en nuestro país, cuyo conocimiento a nivel molecular permitirá abordar de forma racional medidas de control efectivas a futuro. No solo llaman la atención por las patologías que generan, el conocimiento de los procesos que en ellos tienen lugar brinda información relevante a nivel evolutivo y de interacción, pues combinan características tanto de procariotas como de eucariotas, presentando en algunos casos situaciones únicas de adaptación. El NAD es una molécula de gran importancia a nivel celular como cofactor de numerosas oxidoreductasas, precursor de movilizadores de calcio y sustrato para la modificación covalente de proteínas (Ziegler M. 2000) El estudio paralelo en estos organismos nos ha permitido identificar la(s) enzimas centrales en la síntesis del NAD en los mismos. En nuestro grupo hemos identificado varias NMNATs, entre estas, 2 en Giardia (Buitrago, J., 2008), 1 en Plasmodium (Marin, C., 2010) y 1 en Leismania (Contreras, L. E., 2009, Neme, R., 2009). Esta evidencia plantea un escenario interesante que posiblemente sea la punta de un hilo que nos lleve a entender mejor la síntesis del NAD y las interacciones parásito-hospedero. El NAD se encuentra ampliamente distribuido en la naturaleza y es una molécula que participa en múltiples procesos celulares (metabolismo energético, sistema REDOX, modificación covalente de proteínas, generación de intermediarios, movilizadores de calcio, entre otros). Nuestras células, al igual que las de todos los eucariotas superiores poseen 3 NMNATs cuya localización celular se ha establecido experimentalmente, (NMNAT1 en núcleo, NMNAT2 en Golgi y NMNAT3 en mitocondria). Estas enzimas aseguran el suministro de NAD a los procesos que se realizan en estos organelos (Berger F. et al 2005). La levadura, como eucarionte primitivo, presenta 2 isoenzimas (Emanuelli M. et al 2003) al igual que Giardia, parasito extracelular del intestino de vertebrados. La localización intracelular de estas NMNATs aun no se ha determinado. El hallazgo de una única NMNAT en los modelos de parásitos intracelulares Plasmodium y Leishmania, es un hecho relevante que podría revelar un punto importante de dependencia entre la célula hospedera y el parásito. Desde este punto de vista, es importante determinar la localización intracelular de la única NMNAT presente en estos modelos y las señales que lo permiten. Las NMNATs que hemos identificado han sido clonadas y expresadas en sistemas procariotas purificadas y evaluadas en cuanto a su actividad enzimática mediante el uso de ensayos enzimáticos acoplados. Igualmente, hemos realizado estudios bioinformáticos de búsqueda de secuencias de localización y predicción estructural de estas enzimas, sin embargo, no se ha logrado identificar su posible señal de localización intracelular. Este proyecto presenta como objetivo general determinar la localización de la NMNAT de Leishmania, con el deseo de continuar el estudio del metabolismo del NAD en protozoos parásitos intracelulares. Además se plantea evaluar como determinantes de localización 2 secuencias exclusivas de las NMNAT del género, las cuales no presentan homología alguna con otros organismos. Se emplearán dos aproximaciones metodológicas para establecer la localización intracelular de la LbNMNAT: i) Uso del trasgen-GFP en parásitos transfectados transientemente mediante microscopia de fluorescencia y ii) mediante el desarrollo de anticuerpos específicos en gallina contra la LbNMNAT. Adicionalmente, para evaluar las secuencias únicas de Leishmania como señales de localización, se empleará el sistema de transgen usando formas mutantes.