El marchitamiento vascular causado por el patógeno Fusarium oxysporum f. sp. dianthi es la enfermedad de mayor impacto para el cultivo del clavel en el mundo. La presencia de esta enfermedad en Colombia ha generado pérdidas a nivel económico y una disminución significativa en el cultivo de esta flor. Diversos esfuerzos se han desarrollado con el fin de generar alternativas eficientes para su control, pero a la fecha no existe un plan de manejo que permita controlar totalmente y son frecuentes los brotes de la enfermedad en los cultivos. La poca información que se tiene sobre las bases bioquímicas y moleculares de la resistencia a la enfermedad, ha generado un retraso en el desarrollo de nuevas alternativas como la generación de variedades resistentes. A pesar de esto, algunos estudios previos han permitido postular que dentro de los mecanismos de defensa que pueden activar las variedades resistentes para afrontar la infección, se destaca la biosíntesis de compuestos con actividad antifúngica, además de procesos de lignificación y suberización. Se ha determinado que algunas proteínas extracelulares secretadas al apoplasto por la planta, pueden también ser importantes durante la interacción con este patógeno. Esta evidencia coincide con lo propuesto para otras plantas en donde se ha encontrado que en los espacios intercelulares, en donde se establece el primer contacto entre la célula hospedante y el patógeno, se presentan algunos de los fenómenos bioquímicos de reconocimiento y defensa determinantes de resistencia o susceptibilidad. Sin embargo, a la fecha en el clavel, es poco el conocimiento que se tiene sobre los procesos que a este nivel celular, se presentan durante la interacción con el agente causal del marchitamiento vascular. Es por ello que en la presente propuesta se plantea un estudio proteómico comparativo que busca encontrar proteínas asociadas a fenómenos que a nivel del apoplasto, están relacionados con resistencia o susceptibilidad. Para ello se plantea un ensayo in vivo bajo condiciones de invernadero, similares a las que se lleva a cabo la producción comercial de esta flor, con dos variedades de clavel con diferencias en los niveles de resistencia. Bajo dichas condiciones y un diseño experimental apropiado, se evaluarán los proteomas apoplásticos presentes en plantas de los diferentes genotipos, sometidos a la infección con el patógeno. Para ello se plantea la comparación de perfiles proteicos usando electroforesis en 2D y posterior identificación usando huella peptídica MALDI-TOF, así como el uso de técnicas label-free no electroforéticas que incluyen análisis comparativos usando HPLC-MS/MS. Así mismo, para aquellas proteínas que sean consideradas de interés por su posible asociación con resistencia o susceptibilidad, se determinarán sus niveles transcripcionales usando realtime PCR. De esta manera, además de validar los resultados encontrados a nivel proteómico, se puede inferir si los puntos de regulación de las respuestas de defensa incluyen la transcripción génica; información considerada importante cuando se busca aumentar la expresión de un gen particular. Es importante resaltar, que en conjunto los resultados encontrados a nivel bioquímico y molecular, deben ser contrastados con el comportamiento en campo para validar su papel durante la interacción. Por esta razón se evaluarán algunos parámetros eco-fisiológicos en las plantas usadas durante el estudio, con el fin de verificar además de su resistencia o susceptibilidad a la enfermedad, el posible efecto de la inoculación con el patógeno sobre otros procesos de la planta. La comparación estadística de estos resultados a nivel fisiológico, con los obtenidos tanto a nivel proteómico y transcripcional, permitirá proponer un panorama de aquellos procesos que se presentan a nivel del apoplasto durante la interacción con el patógeno y que pueden ser centrales en esta interacción planta-patógeno. |