Colombia es el segundo exportador mundial de flores a nivel mundial, del 98% de la producción de flores exportadas el 16% corresponde a clavel. Esta planta es atacada por el hongo Fusarium oxysporum f.sp. dianthi (Fod) que le ocasiona marchitamiento vascular y se controla con la ayuda de fungicidas u otros métodos que encarecen la producción de flores cortadas. La presencia del patógeno y de residuos de fungicidas colocan en riesgo el adecuado manejo fitosanitario, requisito necesario para la aceptación de las flores en el mercado internacional. Los patógenos para efectuar la colonización del hospedero, inducen la secreción de una serie de enzimas hidrolíticas dirigidas a vencer la primera barrera pasiva en las plantas que es la pared celular. Entre las enzimas secretadas por los patógenos se encuentran la xilanasa que contribuye a degradar los xiloglucanos, la pectin liasa dirigida a colaborar en la degradación de pectina, y las proteasas destinadas a hidrolizar las proteínas ricas en hidroxiprolina que se encuentran en la pared celular de las plantas . En diferentes modelos de interacción hospedero-patógeno tanto en bacterias como en hongos se han efectuado estudios para considerar si las enzimas hidrolíticas son o no factores de virulencia, encontrando resultados variables según el modelo, en algunos ciertas enzimas hidrolíticas se consideran factor de virulencia, en otros los resultados no han sido concluyentes, en parte atribuido a la redundancia de genes que presentan esta clase de enzimas y en otros definitivamente no se consideran factor de virulencia.. Sin despreciar ninguno de los resultados obtenidos es claro que la presencia o inducción de estas enzimas son medios necesarios para que el patógeno pueda avanzar al tejido vascular y colonizar al hospedero. En el presente proyecto se plantea el estudio del patrón de inducción y de transcripción de las enzimas xilanasa, proteasa, pectin liasa secretadas por Fusarium oxysporum f.sp. dianthi en la colonización a su hospedero el clavel (Dianthus Caryophyllus L.) en presencia de pared celular de variedad susceptible y tolerante, tema que no se encuentra desarrollado en el modelo Fod-clavel. Los resultados del proyecto permitirán conocer si se inducen estas enzimas, los niveles de inducción y transcripción, el comportamiento de los niveles través de los primeros días de infección. La realización de un estudio paralelo de la expresión y transcripción para estas enzimas permitirá establecer si hay puntos de regulación entre estos dos procesos o son continuos a nivel celular. Estos resultados también van a permitir establecer las diferencias en los resultados para los niveles de transcripción y expresión de las enzimas propuestas frente a dos variedades de clavel con grados de resistencia diferentes al patógeno. De acuerdo con los anteriores resultados se seleccionarán las enzimas que presenten mayor interés para purificarlas y caracterizarlas parcialmente. El desarrollo de la parte experimental para cumplir con los objetivos propuestos consistirá en realizará un cultivo in vitro de Fod en medio líquido de papa, durante un periodo de 10 días aproximadamente, en el cual se inducirá la producción de las enzimas propuestas con pared celular de variedad susceptible y resistente de raíz de clavel, cada uno de los ensayos realizados contará con su respectivo control. Las actividades enzimáticas se medirán a partir del medio líquido. Se determinarán las mejores condiciones de actividad para cada una de las enzimas estudiadas ( tiempo de reacción, concentración de enzima, pH, temperatura, concentración de sutrato) con lo cual se inicia una caracterización de las enzimas propias del hongo en extracto crudo. El micelio, de cada uno de los ensayos, se utilizará para aislar el RNA y a partir de este realizar RT-PCR con el fin de amplificar y cuantificar los productos de los genes en estudio. Para la elaboración del cDNA y del amplificado se diseñarán primers específicos para cada una de las enzimas propuestas. Paralelo a cada ensayo se correrá un gen houskeeping. La purificación de las enzimas se llevará a cabo utilizando la metodología clásica de purificación de proteínas con resinas de intercambio iónico, tamiz molecular o hidrofóbicas.