Los rotavirus son agentes causales de enfermedades gastrointestinales en niños menores de cinco años y en algunos animales jóvenes de interés económico, como mamíferos y aves. A causa de la deshidratación por la diarrea inducida por rotavirus ocurren más de 592.000 muertes anuales en el mundo. Los niveles avanzados de higiene son incapaces de controlar la expansión de infecciones por rotavirus, ya que la incidencia es similar tanto en países desarrollados como en países subdesarrollados; por ello es fundamental el conocimiento básico de los mecanismos moleculares implicados en la interacción rotavirus-célula, para eventualmente desarrollar estrategias de protección contra la infección por este virus. Existen reportes en líneas celulares que indican que las interacciones de las proteínas virales con los receptores celulares se llevan a cabo de manera secuencial implicando cambios conformacionales en las proteínas del virión que permitirían desplegar dominios escondidos para proseguir con la unión y penetración del rotavirus a la célula. Entre las moléculas implicadas en la interacción con rotavirus están los glicoconjugados y proteínas de interacción especifica de dominio como las integrinas alfa2beta1, alfa 4beta1, alfa xbeta2, alfa vbeta3, y la proteína Hsc70; además una tesis de doctorado que se desarrolla en nuestro laboratorio encontró que la Proteína Disulfuro Isomerasa (PDI) también participa en el proceso de entrada de los rotavirus en las líneas celulares MA104 y Caco-2, utilizando virus RRV y Wa, adaptados a éstas líneas. En dichas células las moléculas se han encontrado asociadas a los microdominios lipídicos “rafts” de la membrana celular. Los rotavirus infectan primordialmente el ápice de las vellosidades del intestino delgado. Los mecanismos moleculares y las etapas de interacción del rotavirus con estas células aun no han sido elucidados. Es importante determinar si un virus silvestre (no adaptado a líneas celulares) utiliza estas mismas moléculas receptoras en un modelo in vivo. Tal determinación podría resolverla hipótesis sobre la posible universalidad de dichos receptores, aunque que puede haber disparidad entre lo que ocurre en líneas celulares y lo que ocurre in vivo. Nuestro grupo de investigación encontró que las proteínas Hsc70 y la integrina alfavbeta3 se encuentran asociadas a la membrana de los enterocitos de ratón, inmersas en los microdominos lipídicos “rafts”. Los enterocitos son células diferenciadas terminales, cuya viabilidad es afectada por el proceso de aislamiento, por esta razón no existen protocolos reproducibles y rutinarios que permitan tener cultivos primarios de enterocitos de ratón lactante. Ensayos preliminares durante la primera fase del proyecto sugirieron que la viabilidad celular aumenta si durante el proceso de aislamiento se mantiene la vellosidad completa, por lo tanto uno de nuestros propósitos será caracterizar el aislamiento, la viabilidad e infección de dichas vellosidades intestinales. Pruebas preliminares indicaron que ligandos de las proteínas en estudio inhiben la entrada del virus a las células de la vellosidad. Otro objetivo de este proyecto será estudiar si la proteína recientemente descrita, PDI, que está implicada en el proceso la infección por rotavirus, se encuentra asociada a la membrana de los enterocitos, inmersa en los microdominios lípidicos “rafts”, formando complejos proteícos con la Hsc70 y la alfa vbeta3. Igualmente analizaremos si al adicionar a las vellosidades intestinales anticuerpos específicos contra las proteínas Hsc70, alfavbeta3 y PDI, éstos bloquean la entrada del rotavirus Ecwt a las células de la vellosidad; esta cepa rotaviral Ecwt homóloga, solo puede ser ampliada por propagación in vivo, durante infecciones sucesivas en ratones. Para cumplir las propuestas antes mencionadas, se estandarizará el aislamiento de las vellosidades intestinales de ratón lactante, determinando la viabilidad utilizando Hoesch, azul tripano, ioduro de propidio, LDH y caspasa 3. Igualmente se correlacionará esta viabilidad con un proceso infeccioso de rotavirus, medido a través del tiempo para determinar las concentraciones óptimas de virus y el tiempo necesario para evaluar la infección. Se determinará mediante la técnica de citometría de flujo, si PDI está presente en la membrana de los enterocitos, junto con las proteínas Hsc70 y alfa vbeta3 ya examinadas en trabajos anteriores. Se realizará el aislamiento de los microdominios lipídicos “rafts” mediante gradientes de sacarosa con el fin de determinar los posibles complejos proteícos que incluyan las proteínas PDI, Hsc70 y alfavbeta3, los cuales serán analizados por electroforesis-inmunoblot y ELISA. El rotavirus Ecwt será propagado en 50 ratones, cuyas heces e intestinos serán recolectados, purificando el virus mediante extracción con solvente orgánico y ultracentrifugación en gradiente de CsCl. Una vez estandarizado el cultivo primario de las vellosidades, éstas se incubarán en presencia y ausencia de anticuerpos específicos contra las proteínas PDI, Hsc70 y alfa vbeta3, luego se infectarán con rotavirus y se analizará el proceso infeccioso, comparándolo con las células libres de anticuerpo mediante las técnicas de ELISA, inmunocitoquimica y citometría de flujo. Como control de anticuerpos de utilizarán isotipos de anticuerpos no relevantes; como control de especificidad de infección se utilizará reovirus. Con los resultados obtenidos se espera determinar si en el modelo ratón en un sistema homólogo, las proteínas Hsc70, PDI y alfavbeta3 actúan en el proceso de entrada del rotavirus a las células de las vellosidades intestinales. Se espera lograr graduar un estudiante de postgrado a nivel de Maestría y difundir los resultados obtenidos en un evento de carácter nacional junto con una publicación nacional. Este proyecto hace parte de la línea de investigación en rotavirus que adelanta el grupo de Biología Molecular de Virus de la Facultad de Medicina, que en la actualidad tiene vinculados estudiantes de Doctorado y Maestría, con la proyección de continuar fortaleciendo la capacidad científica nacional con la formación de nuevos investigadores.