Las enfermedades conocidas como leishmaniasis afectan millones de personas en el mundo. En Colombia se reportaron más de 12000 casos en el 2009 y hasta la semana epidemiológica 19 del 2010, se han reportado más de 4400 casos . De estos casos alrededor del 99% corresponden a leishmaniasis cutánea y la fracción restante a leishmaniasis mucocutánea y visceral. Por esta razón se considera a la leishmaniasis como un problema de salud púbica en el país. Pese a esto, existe un repertorio escaso de medicamentos y tratamientos terapéuticos para la enfermedad y hay evidencia de resistencia del parásito al tratamiento más utilizado (Antimonios pentavalentes). En un contexto general de enfermedad, las estrategias utilizadas actualmente para la búsqueda de dianas terapéuticas involucran aproximaciones genómicas, proteómicas, bioinformáticas y de tamizaje fenotípico causado por compuestos químicos y moléculas pequeñas. Muchas de estas aproximaciones requieren de modelos experimentales adaptados a plataformas de tamizaje fenotípico de alto rendimiento, en los que se evalúa un gran número de compuestos de manera simultánea y eficiente para la identificación de posibles dianas terapéuticas para patologías particulares. En el caso de leishmaniasis se han utilizado algunas de estas aproximaciones, pero aún no se ha explorado de manera sistemática el efecto de la modulación genética a nivel de la célula hospedera como un mecanismo de entendimiento de su interacción con el parásito. Una comprensión extensa de la maquinaria celular hospedera necesaria para el proceso de infección por parte del parásito, brindará nuevas luces con respecto a las alternativas para el control del parásito. En este proyecto se plantea la generación y validación de un modelo celular explícitamente diseñado para facilitar la identificación sistemática de los genes del macrófago necesarios para el proceso de infección por parte de Leishmania braziliensis, en plataformas de alto rendimiento. Este modelo permitirá utilizar silenciamiento genético mediado por RNA de interferencia. El funcionamiento de los eventos de silenciamiento, podrá verificarse gracias a un gen reportero (EmGFP) expresado de manera constitutiva en el macrófago. En el marco del proyecto, el modelo será validado mediante la confirmación experimental de su habilidad para: 1. Permitir infección in vitro por parte de Leishmania braziliensis en proporciones similares a las registradas en macrófagos normales. 2. Permitir la verificación fenotípica del silenciamiento del gen reportero (EmGFP) de manera simultánea con el silenciamiento de un gen de interés (gen modelo). 3. Permitir la verificación fenotípica del efecto del silenciamiento genético, en el contexto del macrófago infectado in vitro, con Leishmania braziliensis. Esta verificación fenotípica debe ser compatible con experimentos realizados en plataformas de alto rendimiento y por lo tanto debe requerir un mínimo de manipulación experimental. El objetivo general del proyecto es: Generar un modelo celular de macrófagos para la identificación de fenotipos inducidos por silenciamiento genético con RNA de interferencia, en el contexto del macrófago infectado por L. braziliensis y validar este modelo mediante la evaluación del efecto del silenciamiento de un gen con expresión diferencial en macrófagos infectados por este parásito. Este objetivo se cumplirá mediante el desarrollo de los siguientes objetivos específicos: 1. Generar una línea celular de macrófagos con expresión constitutiva de al menos una proteína fluorescente a manera de gen reportero. Metodología: Se implementará un método de transducción lentiviral para la modificación genética de la línea celular humana U937, con el fin de generar los precursores de macrófagos con expresión constitutiva de EmGFP. Como alternativa de marcación fluorescente constitutiva, se generará una línea celular derivada de U937, con expresión de la proteína marcadora de membrana: DsRed-Monomer-Mem (DRMM). Las líneas celulares derivadas generadas serán caracterizadas en términos de su capacidad para su diferenciación a macrófagos inducida por phorbol-myristate acetate (PMA). 2. Estandarizar el proceso de infección in vitro de la línea celular fluorescente de macrófagos con Leishmania braziliensis. Metodología: Las líneas celulares fluorescentes generadas serán caracterizadas en términos de su capacidad para ser infectadas por promastigotes metacíclicos de Leishmania braziliensis. 3. Estandarizar un método de silenciamiento genético mediado por RNA de interferencia compatible con un sistema de tamizaje genético. Metodología: Utilizaremos transducción de vectores lentivirales codificantes para shRNAs dirigidos contra el gen reportero (EmGFP) y contra un gen control (LMNA). Como control negativo utilizaremos constructos codificantes para shRNAs con secuencias que no interfieren con ningún gen conocido. En cada caso se diseñarán y generarán 4 shRNAs diferentes dirigidos contra el mismo gen. El proceso de silenciamiento genético será verificado mediante un seguimiento en el tiempo de los niveles de EmGFP y Lamin A, mediante fluorescencia, inmunofluorescencia y Western Blot. Una vez verificado el sistema de silenciamiento genético, se implementará su uso en formato de placas de 96 pozos para lectura bajo microscopía de fluorescencia. 4. Identificar mediante ensayos de microarreglos, genes con expresión diferencial entre macrófagos control versus infectados con L. braziliensis. Metodología: Se contratará el servicio de análisis de expresión génica diferencial mediante microarreglos en la plataforma Affymetrix. Se utilizará el sistema "GeneChip® Human Exon 1.0 ST Array" con el fin de determinar variaciones tanto a nivel de genes específicos, como de variantes de splicing alternativo, comparando macrófagos no infectados versus macrófagos infectados. El análisis se realizará en tres ocasiones independientes cada una por triplicado. El tiempo posinfección en el que se realizará el análisis, se determinará con anterioridad de acuerdo con los resultados de estudios de cinética de crecimiento del parásito durante infecciones in vitro. Los resultados del análisis de expresión diferencial, permitirá la selección de un gen de interés, el cual será utilizado para la validación final del modelo. 5. Evaluar el efecto del silenciamiento genético de un gen diferencialmente expresado en macrófagos infectados por L. braziliensis, mediante RNA de interferencia. Metodología: Una vez seleccionado un gen de interés, dentro del panel con expresión diferencial en macrófagos infectados con Leishmania braziliensis, se diseñarán y generarán 4 shRNAs diferentes dirigidos contra el mismo gen. El proceso de silenciamiento genético será verificado mediante un seguimiento en el tiempo de los niveles de proteína, mediante fluorescencia, inmunofluorescencia y Western Blot. Una vez verificado el silenciamiento genético simultáneo del gen de interés y del gen reportero, se evaluará el fenotipo causado por dicho silenciamiento, en el macrófago infectado. Dicho fenotipo será caracterizado cuantitativamente, mediante la determinación de los parámetros: Porcentaje de infección (porcentaje de macrófagos infectados) y carga parasitaria (número de parásitos por macrófago infectado) y comparado con macrófagos (normales y fluorescentes) infectados control sin silenciamiento y con macrófagos (normales y fluorescentes) infectados control transducidos con shRNAs no relevantes. El modelo celular generado y validado como consecuencia de este proyecto, servirá para la identificación sistemática de los genes del macrófago necesarios para el proceso de infección por parte de Leishmania braziliensis. Adicionalmente, el proyecto brindará como parte de sus resultados, un perfil de expresión diferencial de genes del macrófago infectado por este parásito y por lo tanto un primer grupo de genes candidatos para los estudios de tamizaje genético. Este modelo celular constituirá una plataforma de investigación invaluable no solo para el estudio de interacciones parásito-hospedero, sino para la identificación de posibles dianas terapéuticas en un futuro cercano.