La tuberculosis (TB) es la principal causa de muerte por un agente infeccioso en el mundo, enfermedad que produjo más de 10 millones de nuevos casos en 2018. El control de la TB se ha complicado recientemente por la aparición de cepas multi-farmacorresistente (MDR y XDR-TB), la coinfección con VIH y la capacidad de adaptación del agente etiológico M. tuberculosis (Mtb) a la respuesta inmune del hospedero [1]. Actualmente, la única vacuna disponible contra la TB es la cepa atenuada BGC, efectiva para proteger formas diseminadas de TB en niños pero muy variable contra la TB pulmonar, la forma más común de la enfermedad [2–4]. Por lo tanto, existe una necesidad creciente de contar con nuevos candidatos a vacunas anti-TB. En la actualidad están en desarrollo una variedad de candidatos a vacunas anti-TB tanto terapéuticas como preventivas, y en diferentes fases de estudio [2–4]. Entre los nuevos candidatos, las cepas vivas atenuadas de Mtb son los más promisorios, toda vez que conservan regiones génicas de Mtb ausentes en BCG, y que codifican antígenos importantes inmunodominantes (ESAT6, CFP10, Ag85, entre otros), que podrían generar un estímulo inmune más fuerte y prolongado en comparación con BCG [4–7]. Para el diseño de una mutante atenuado de Mtb es indispensable profundizar en los mecanismos que hacen del bacilo tuberculoso un patógeno intracelular exitoso, e identificar dianas claves para su atenuación. En este sentido, algunos estudios han resaltado la importancia de las ATPasas tipo P, una gran familia de proteínas transmembranales indispensables para mantener la homeóstasis celular y generar los gradientes electroquímicos apropiados para la supervivencia celular [8–11]. De hecho, las ATPasas tipo P de Mtb responden frente a la toxicidad producida por los altos niveles de metales al interior de los macrófagos humanos durante los procesos de infección [12–15]. Nuestro grupo de investigación “Bioquímica y Biología Molecular de las Micobacterias (BBMM)” de la Universidad Nacional de Colombia, en la última década se ha dedicado a caracterizar el transporte iónico mediado por ATPasas tipo P de Mtb, y en la construcción de mutantes de Mtb por recombinería. En una fase anterior a este proyecto se generaron mutantes defectivos en los genes ctpF y ctpH de Mtb, que codifican ATPasas involucradas en el transporte de Ca2+, los que mostraron hipersensiblidad frente agentes oxidantes (peróxido de hidrógeno y nitroprusiato de sodio), sugiriendo un vínculo entre el transporte de Ca2+ y los mecanismos que utiliza Mtb para neutralizar las especies reactivas de oxígeno y nitrógeno (ROS/RNS), y lo más importante se conoce que al menos uno de ellos (ΔctpF) muestra una virulencia disminuida, convirtiéndolos en candidatos promisorios para el diseño de cepas atenuadas de Mtb con potencial vacunal. Por otra parte, para la construcción de vacunas anti-TB basadas en cepas vivas atenuadas se deben cumplir los requisitos del Consenso de Ginebra, entre los cuales la no presencia de marcadores de resistencia antibiótica que usualmente se introducen en la construcción de mutantes, y contar con al menos dos mutaciones independientes no reversibles relacionadas con virulencia, con el objetivo de disminuir al máximo la reversión al fenotipo parental [16–18]. Por lo tanto, en el presente proyecto se propone obtener mutantes de Mtb defectivos en los genes ctpF y ctpH, eliminando los marcadores de resistencia antibióticos previamente introducidos en su construcción. Estos mutantes serán transformados con un plásmido de recombinería necesario para la introducción de una segunda mutación en el gen mmpL7 que codifica para un transportador de membrana directamente relacionado con la biosíntesis de PDIM (dimicocerosato de tiocerol), un reconocido factor de virulencia de Mtb. Por lo tanto, el desarrollo del presente proyecto sería un paso muy importante para nuestro objetivo de diseño y construcción de un doble mutante atenuado de Mtb con p