La Hemofilia A es el trastorno de la hemostasis más frecuente. La hemofilia A es un trastorno recesivo ligado al cromosoma X con una incidencia global de 1:5000 nacimientos, afecta principalmente a los hombres y en raras ocasiones a las mujeres. Se estima que en el mundo hay unos 170.000 pacientes con esta condición y 2/3 de los pacientes no tienen acceso al tratamiento profiláctico debido a su alto costo. La deficiencia en el Factor VIII de la coagulación hace que los pacientes sangren fácilmente. El sangrado espontaneo en cavidades articulares, como ocurre en la rodilla, conduce a degeneración articular y mucho dolor. Clínicamente la Hemofilia A se presenta en forma severa en cerca del 60% de los pacientes (factor VIII de coagulación por debajo del 1% del valor normal), 15% tienen la forma moderada de la enfermedad (nivel de factor entre el 1-5% del valor normal) y un 25% de los pacientes tienen la forma leve de la enfermedad (factor de coagulación entre el 6 al 30% del nivel normal). El gen que codifica el Factor VIII de la coagulación se encuentra ubicado en Xq28 y tiene un tamaño de 186 kb, de los cuales 177 kb corresponden a secuencias intrónicas El gen contiene 26 exones que varían en tamaño desde 69 pb hasta 3106 pb. El gen codifica un mRNA de 9 kb. Entre un 45-50% de los casos, la alteración molecular se debe a un rearreglo molecular debido a una inversión localizada en el intrón 22 del gen (INV22) Este rearreglo separa los exones 1-22 de los expones 23 al 26 del gen. Este rearreglo se presenta por intercambio recíproco de secuencias homólogas ubicadas en el intrón 22 (int22h-1) y otra secuencia homóloga de la cual existen dos copias adicionales (int22h-2 e int22-h3) ubicadas en dirección al telómero 400 kb corriente arriba del gen. Un 0.5-5% de los casos, se deben a una segunda inversión por recombinación de secuencias homólogas ubicadas en el intrón 1 (INV1) y la otra 200 kb corriente arriba del gen. Cerca del 50% restante de las mutaciones incluyen tanto grandes deleciones o grandes inserciones, pequeñas InDel, y mutaciones puntuales (sin sentido y cambio de sentido). En países desarrollados debido a la disponibilidad de métodos de diagnóstico como la secuencia de nueva generación, permite la identificación de las alteraciones moleculares existentes en cada paciente. Sin embargo, en países como el nuestro, estas tecnologías no están disponibles localmente, lo que implica el envío de las muestras fuera del país para su análisis con costos que oscilan entre los US$1500-2500 por muestra. La presente propuesta plantea un análisis sistemático para la identificación de la alteración molecular en cada paciente con hemofilia A, mediante la aplicación de una reacción IS-PCR (Inverse shifting PCR) para la identificación de las inversiones de los intrones 22 y 1 (INV22 e INV1) como una variante de la PCR inversa utilizada por Rossetti et al (2005) seguida del análisis de los exones del gen del FVIII mediante PCR-HRM (High Resolution Melting) y secuenciación mediante BigDye terminators en aquellos exones que presenten alteración en HRM. La metodología de HRM permite el análisis y comparación de las curvas de fusión de las cadenas de ADN, en donde las cadenas bicatenarias de ADN en presencia de un colorante fluorescente, se van separando a medida que la temperatura va aumentando de 55 a 95oC. A medida que las cadenas se separan, la fluorescencia va disminuyendo, obteniendose una curva melting o de fusión de cada cadena de ADN, lo cual permite la detección de la variación en las secuencias analizadas, ya que el cambio de un solo nucleótido en la secuencia de ADN genera variación en la temperatura de desnaturalización del ADN. Con esta aproximación diagnóstica, se espera generar una aproximación sistemática y altamente costo-efectiva para el diagnóstico de mutaciones en la totalidad de pacientes con hemofilia A (FVIII) en nuestro medio, permitiendo así un diagnóstico preciso y una asesoría genética eficaz.